Detalles del proyecto

Duración:2011-2011
Nombre:Extracción y secuenciación de ADN a partir de muestras osteológicas
Código:AAEE0184/09
Acrónimo:ADNOSTEO
Resumen:

<!-- @page { margin: 2cm } P { margin-bottom: 0.21cm } -->

TÍTOL: EXTRACCIÓ I SEQÜENCIACIÓ D'ADN A PARTIR DE MOSTRES OSTEOLÒGIQUES

 

Justificació

A l'Institut Mediterrani d'Estudis Avançats es venen realitzant des de l'any 2007 tasques de recerca relacionades amb l’estudi de la diversitat biològica emprant tècniques de genètica molecular de l'ADN. Aquestes tècniques poden ser complementàries a tècniques de zoologia clàssica però altres vegades són l'única aproximació per a respondre preguntes que d'altra manera no tendrien resposta. Entre aquestes destacaríem:

  1.  
    1.  
      1. Anàlisis filogeogràfiques que ens mostrem com es distribueix geogràficament la diversitat biològica de les poblacions i conèixer el seu origen tant geogràfic com temporal, i que permet, entre d’altres, gestionar programes de recuperació d'espècies en perill.

      2. Classificació taxonòmica de mostres biològiques minúscules o deteriorades i la seva assignació a una espècie o població mitjançant un codi de barres d’ADN (DNA barcoding) que és específic per a cada tàxon.

El laboratori de Zoologia Molecular de l’IMEDEA té una gran experiència en estudis que estimen la diversitat biològica mitjançant aquest codi de barres d'ADN a artròpodes, com per exemple:

  1.  
    1.  
      1. El projecte PANCODING finançat per la Fundació BBVA on es va estimar morfològicament i genèticament la diversitat biològica de les aranyes de l’istme de Panamà. Es varen recol·lectar més de 30000 espècimens i s'obtengueren més de 3500 codis de barres de l'ADN, i particularment de juvenils que, al no tenir caràcters morfològics diagnòstics, no s'haguessin pogut determinar nivell taxonòmic.

      2. El projecte METADNA on es realitzà la filogeografia d’un endemisme balear de coves i pous, l’amfípod Metacrangonyx longipes. S'estudiaren 160 espècimens i 24 localitats, el que permeté establir que la diversificació d'aquest llinatge estava relacionada amb la dessecació del Mediterrani de fa 5,3 Ma i que existia una gran diversitat genètica però una èxtasi morfològica.

      3. El projecte WATERBEAS on es realitzà un estudi de més de 1500 escarabats aquàtics d'Austràlia, que corresponen al 90% de les espècies conegudes en aquell continent, per a conèixer la diversitat críptica tant a nivell d'espècies com de poblacions.

El nostre grup està especialitzat en extreure ADN de mostres fresques o mostres recents conservades en etanol. Malauradament, molts estudis requereixen la utilització de mostres més antigues i preservades en condicions no òptimes, com per exemple mostres d'ossos de museus o espècimens de col·leccions entomològiques que es guarden seques. Aquestes mostres són de gran vàlua perquè moltes vegades les especies o poblacions ja estan extingides a la natura, però no obstant això, són crucials per a comprendre la diversitat actual. En els darrers anys, existeix un creixent interès a nivell mundial de les tècniques d'extracció i seqüenciació d'ADN provinent de mostres d'ossos, tant actuals com fòssils. Resulta destacable els avanços que s'han fet en l'estudi dels neandertals i dels mamuts (e.g., Poinar et al., 2006; Green et al., 2006) a partir d'ADN preservats en ossos o teixits congelats. Els materials disponibles per a l'estudi d'una espècie extingida o en perill d'extinció estan pràcticament restringides a col·leccions osteològiques de museus d'història natural o centres d'investigació.

 

Definició dels objectius perseguits

L'objectiu principal d'aquesta acció és posar a punt la metodologia d'extracció i la amplificació per reacció en cadena de la polimerasa (PCR) d'ADN mitocondrial a partir d'ossos, tècnica no emprada mai a l'IMEDEA i amb la intenció que tengui continuïtat amb l'obtenció i seqüenciació d'ADN obtingut de mostres osteològiques fòssils. En concret, es seqüenciaran fragments mitocondrials de la Regió Control (RC) i Citocrom b (cob o cytb). Aquestes regions són molt variables i són les més habitualment emprades en els estudis moleculars de vertebrats.

Com que a l'actualitat no es disposa a les dependències de l'IMEDEA de la infraestructura necessària per a l'extracció d'ADN d'ossos fòssils (veure, per exemple, Adler et al., 2011), la metodologia inicialment es posarà a punt amb materials osteològics actuals. Per tant, s'ha elegit com a espècie diana per a aquest estudi la musaranya Suncus etruscus bàsicament per dos motius:

 

(1) Es disposa d'abundant material osteològic procedent d'egagròpiles d'òliba (Tyto alba) col·lectades als anys 70 a diferents indrets d'Espanya, França i Itàlia. Aquest material permetrà posar a punt la tècnica que es pretén emprar.

(2) L'espècie sembla haver estat recentment introduïda a les Illes Balears, en concret a Mallorca (Pinya et al., 2008). Es disposa d'uns 25 individus conservats en alcohol recol·lectats a diferents indrets de Mallorca i de la Penínisula Ibèrica (provinents de col·leccions museístiques. Tots els individus de Mallorca han estat recol·lectats de forma accidental [trobats morts, capturats per carnívors domèstics (e.g., moixos), o provinents del COFIB]. Així, es podrà comparar l'ADN obtingut dels ossos amb els dels teixits (per exemple, múscul) dels espècimens actuals i comprovar, així, que no hi ha hagut contaminació amb ADN d'altres espècies que estassin també contingudes a les egagròpiles, així com el de les pròpies òlibes.

 

Addicionalment, l'obtenció d'ADN d'aquesta espècie suposarà incrementar el seu coneixement genòmic degut a que, actualment, només s'ha publicat la seqüència de cytb de tres individus: una de Anuradhapura, Sri Lanka (Meegaskumbura & Schneider, 2009) i dues europees, una de Camargue/La Pèbre, França i una altra de Fivizzano c/o Farina, Itàlia (Dubey et al., 2007). En el cas concret del Suncus de Mallorca, i com a resultat paral·lel de l'aplicació d'aquesta metodologia, l'obtenció de seqúències d'ADN dels espècimens mallorquins permetrà identificar la regió d'orígen de les poblacions d'aquesta musaranya que viuen actualment a l'illa.

 

A la taula 1 es llista el material disponible de Suncus etruscus per a aquest estudi.

 

LOCALITAT

Nº INDIVIDUS

COL·LECCIÓ

Llucmajor (Mallorca)

1

IMEDEA

Porreres (Mallorca)

1

IMEDEA

Bunyola (Mallorca)

6

IMEDEA i MBCN

Algaida (Mallorca)

6

IMEDEA

Manacor (Mallorca)

1

IMEDEA

Santa Eugènia (Mallorca)

2

IMEDEA

Felanitx (Mallorca)

2

IMEDEA

Sant Llorenç (Catalunya)

3

IMEDEA

Catalunya

2

IMEDEA

Doñana

2

EBD

San Fernando de Henares (Madrid)

1

MNCN

L’abadia (Filitosa, Còrsega)

3

IMEDEA

L’Alguer (Sardenya)

3

IMEDEA

Vallmoll (Tarragona)

2

IMEDEA

Borges Blanques (Lleida)

3

IMEDEA

Bienvenida (Badajoz)

3

IMEDEA

Sant Feliu d’Avall (França)

3

IMEDEA

 

Taula 1. Relació d’espècimens de Suncus etruscus disponibles per a aquest estudi. En vermell s’indiquen aquelles mostres que són ossos (en concret, cranis) procedents d’egagròpiles d’òliba. Per a un primer estudi preliminar només s'han triat 2 o 3 cranis de cada localitat, però es disposa de més material. En negre, teixit provinent d’individus complets.

 

 

La metodologia d'extracció d'ADN serà una modificació del protocol descrit per Dubey et al. (2006). El cranis es congelaran en nitrogen líquid i seran pulverizats dins un murter estèril per desprès extreure l’ADN seguint les instruccions del DNA extraction kit de la companyia Qiagen. Aquest kit combina la clàssica digestió del material biològic amb proteinasa K i detergents tipus SDS amb membranes de silici que tenen alta afinitat pels àcids nucleics que els permeten aïllar de proteïnes i altres restes cel·lulars. Per a optimitzar la unió del DNA dels ossos a la matriu s'afegirà a la mostra una alta concentració de tRNAs que augmenten la eficiència de l’extracció d’ADN genòmic. La combinacions de primers cytb i les condicions de PCR estan també indicades en l'article abans esmentat i per la RC a Brändli et al. (2005). La seqüenciació automàtica es realitzarà als serveis científic-tècnics de l’Institut de Biologia Evolutiva de Barcelona (CSIC). Una vegada obtingudes les seqüències, aquestes s'editaran amb el programa CodonCode v3.7 i s'alinearan amb el programa mafft v5.0, les anàlisis filogenètiques es realitzaran amb RAxML v7.2.8 (màxima versemblança) i MrBayes v3.1.2 (Inferència Bayesiana), les poblacionals i filogeogràfiques amb TCS v1.21, MEGA v5, Arlequin v3.5, i les estimacions de les edats i de la taxa de substitució nucleotídica del rellotge molecular amb Beast v1.6.1.

 

Amb aquesta acció, inicialment es pretén treballar amb ossos actuals i agafar la pràctica necessària per a poder aplicar la tècnica de forma rutinària. No es descarta, però, que en un futur proper es puguin iniciar els tràmits per a l'establiment de les infraestructures necessàries per a l'obtenció i seqüenciació d'ADN provinents de materials fòssils o sub-fòssils que podrien resultar de gran interès per al Departament de Biodiversitat i Conservació de l'IMEDEA en general, i per als equips de Paleontologia i de Biologia Molecular en particular. De fet, actualment ja es col·labora habitualment amb l'equip dirigit pel Dr. Carles Lalueza-Fox de l'Institut de Biologia Evolutiva (UPF-CSIC) de Barcelona i, un dels components de l'equip de Paleontologia de l'IMEDEA, el Dr. Pere Bover, està en tràmits per a obtenir finançament per a realitzar una estada a l'Australian Center of Ancient DNA d'Adelaida (Austràlia) dirigit pel Dr. Alan Cooper, per a aprendre les tècniques d'extracció d'ADN fòssil.

 

Relació dels mitjans necessaris

La realització d'aquesta acció requereix la contractació durant 5 mesos d'un Titulat Superior amb coneixements d'extracció d'ADN i d'osteologia (tant fòssil com actual).

A l'IMEDEA ja es disposa d'una laboratori de Biologia Molecular, i tots els materials necessaris ja estan habitualment disponibles a aquest laboratori.

 

Diagrama de temps

 

Tasca/Mes

1

2

3

4

5

Recerca bibliogràfica

Extracció i seqüenciació d'ADN dels materials osteològics

 

Extracció i seqüenciació d'ADN dels teixits

 

Obtenció de mostres addicionals (opcional)

 

 

Anàlisi dels resultats

 

 

Redacció informe

 

 

 

 

 

 

 

Bibliografia

Adler, C.J.; Haak, W.; Donlon, D.; Cooper, A. & The Genographic Consortium. 2011. Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones. Journal of Archaeological Science, 38: 956-964.

Brändli, L.; Lawson Handley, L.-J.; Vogel, P. & Perrin, N. 2005. Evolutionary history of the greater white-toothed shrew (Crocidura russula) inferred from the analysis of myDNA, Y, and X chromosome markers. Molecular Phylogenetics and Evolution, 37: 832-844.

Dubey, S.; Zaitsev, M.; Cosson, J.-F.; Abdukadier, A. & Vogel, P. 2006. Pliocene and Pleistocene diversification and multiple refugia in a Eurasian shrew (Crocidura suaveolens group). Molecular Phylogenetics and Evolution, 38: 635-647.

Dubey, S.; Salamin, N.; Ohdachi, S.D.; Barriere, P. & Vogel, P. 2007. Molecular phylogenetics of shrews (Mammalia: Soricidae) reveal timing of transcontinental colonizations. Molecular Phylogenetics and Evolution, 44 (1): 126-137.

Green, R.E.; Krause, J.; Ptak, S.E.; Briggs, A.W.; Ronan, M.T.; Simons, J.F.; Du, L.; Egholm, M.; Rothberg, J.M.; Paunovic, M. & Pääbo, S. 2006. Analysis of one million base pairs of Neanderthal DNA. Nature, 444: 330-336.

Meegaskumbura, S.H. & Schneider, C.J. 2009. A taxonomic evaluation of shrew Suncus montanus (Soricidae: Crocidurinae) of Sri Lanka and India. Ceylon Journal of Science (Biological Sciences), 37 (2): 129-135

Pinya, S.; Canyelles, X.; López-Fuster, M.J.; Trenado, S. & Cuadrado, E. 2008. Sobre la presencia de Suncus etruscus (Savi, 1822) en las Islas Baleares. Orsis, 23: 133-135.

Poinar, H.N.; Schwarz, C.; Qi, J.; Shapiro, B.; MacPhee, R.D.E.; Buigues, B.; Tikhonov, A.; Huson, D.H.; Tomsho, L.P.; Auch, A.; Rampp, M.; Miller, W. & Schuster, S.C. 2006. Metagenomics to paleogenomics: large-scale sequencing of mammoth DNA. Science, 311: 392-394.

Personal relacionado

Grupos de investigación relacionados